注射用生物制藥產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和活性成分(API)的聚集仍然是影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和可用性的主要問題。蛋白質(zhì)聚集可以發(fā)生在蛋白質(zhì)治療藥物生命周期的所有階段，包括表達(dá)，復(fù)性，純化，滅菌，運(yùn)輸，儲存和遞送過程。大家都知道，蛋白質(zhì)聚集的機(jī)制尚不清楚，但是在某些制造階段會增加物理降解和聚集體形成的風(fēng)險，例如配方組成，細(xì)胞培養(yǎng)過程中的微生物或藥瓶污染物的影響，以及藥物儲存過程中存在的化學(xué)降解可能。特別是已經(jīng)證明，儲存容器的環(huán)境起著類似于預(yù)填充注射器的作用，例如，從橡膠塞中漏出的硅油和玻璃分層會誘發(fā)聚集。在國際上對生物制藥產(chǎn)品控制的衛(wèi)生法規(guī)越來越嚴(yán)格的背景下，在生產(chǎn)和儲存過 程中，對治療性蛋白質(zhì)藥物的變性和降解過程進(jìn)行原位監(jiān)測，對生產(chǎn)商和研究人員來說是一個關(guān)鍵的競爭優(yōu)勢
為了解決此類應(yīng)用，法國Cordouan 公司開發(fā)了命名為 VASCO Kin 原位在線納米粒度儀(見下圖)，該分析儀基于實(shí)時原位非接觸式遠(yuǎn)程DLS測量。DLS是膠體科學(xué)和蛋白質(zhì)表征研究中普遍采用的技術(shù)之一，它是基于對粒子布朗運(yùn)動引起的散射光波動分析的成熟且非常強(qiáng)大的技術(shù)[4] 。 它可以在一分鐘內(nèi)精確測量從 0.5nm 到 10um 的顆粒粒度。 盡管當(dāng)今商用DLS系統(tǒng)提供了不同的測量配置，但它們都要求用戶取樣，稀釋，轉(zhuǎn)移到樣品池中，這些操作都可能會影響樣品蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài) 。
原位在線納米粒度儀VASCO Kin 是一種靈活的DLS系統(tǒng)，這得益于其*的光纖遠(yuǎn)程探頭(OFRP)，使傳統(tǒng)DLS的限制問題迎刃而解。 OFRP是一個經(jīng)過優(yōu)化的，高度耐用的光學(xué)機(jī)械組件，可以在無需對樣品分批處理的情況下進(jìn)行直接的、非接觸的測量。通過特殊的光纖連接到光學(xué)單元，OFRP將激光束射入樣品中，并以 170°的角度向后收集樣品的散射光(見下圖)。連接配備專用快速采集電子電路的高靈敏度單光子雪崩光電二極管檢測器(APD)，實(shí)時監(jiān)控散射光強(qiáng)度的波動，并通過強(qiáng)大的數(shù)學(xué)算法將其轉(zhuǎn)換為時間分辨的粒度動力學(xué)分析。
為了證明 原位在線納米粒度儀VASCO Kin 實(shí)現(xiàn)在注射器中非接觸原位測量的能力，我們對一種商用可注射流感疫苗進(jìn)行了一系 列粒徑測量(見圖 1-左)。這種疫苗是一種復(fù)雜的培養(yǎng)基，由多種不同成分混合而成：來自三種不同干細(xì) 胞的去活化和碎片化的病毒，和包括 ppi 水(質(zhì)子泵抑制劑)、氯化鉀、氯化鈉、生理鹽水緩沖液和微量的雞蛋蛋白(卵清蛋白)、甲醛、新霉素、辛醇 9 等幾種賦形劑。為了進(jìn)行測量，從塑料包裝 1 中取出疫苗注射器(見圖 1)，并將其放置在距離Kin遠(yuǎn)程探頭6cm 處的專用支架上(見圖 1-右)。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，即使不去除塑料透明包裝進(jìn)行測量，結(jié)果與去除包裝的結(jié)果也非常一致。
為了比較和證明這種疫苗的老化效應(yīng)，我們將兩支疫苗分別儲存在 7℃的冰箱中和保存在室溫下。各儲存8個月后，在相同的條件下測量了兩個疫苗。其粒度分布結(jié)果如下圖所示
對于儲存在冰箱中的疫苗(圖 2 左)，可以注意到樣品的粒度分布相對復(fù)雜，顯示了從30 nm到800nm 的三個峰值。這些峰值分別對應(yīng)病毒片段和蛋白質(zhì)。另外，還有粒度超過 10µm 的團(tuán)聚體存在。相比之下(圖 2 右)，該疫苗儲存在室溫下清楚地顯示了一些明顯的粒度分布的變化。現(xiàn)在看來像是一個從 10nm到10µm廣泛的連續(xù)分布。上述結(jié)果第一次證明了原位 DLS 測量注射器內(nèi)樣品的有效性和準(zhǔn)確性，并為進(jìn)一步研究所發(fā)生的粒度變化機(jī)理奠定了基礎(chǔ)
用原位在線納米粒度儀VASCO Kin 進(jìn)行非接觸式原位直接測量注射疫苗的納米粒徑及其分布，這具有創(chuàng)新性的意義。它不僅省去了樣品的前處理步驟，節(jié)約了比色皿等耗材，而且為該納米粒度測量系統(tǒng)現(xiàn)場監(jiān)測生物制藥產(chǎn)品中蛋白質(zhì)聚集的情況開辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域。VASCO Kin 還可以用于在各種類型的反應(yīng)器配置耦合[6](雙夾套玻璃反應(yīng)器，高壓和高溫超臨界 CO2高壓釜，微波反應(yīng)器，微流體芯片等)中實(shí)時監(jiān)控納米粒子合成動力學(xué)。
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